کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا از جمله تکنیک‌های جداسازی (Separation) مرسوم است، که در بسیاری از علوم بکار برده می شود. کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا ( (High Performance Liquid Chromatography (HPLC ) بی تردید، سریع ترین رشد را در بین تمام روش های جداسازی تجزیه ای با فروش سالیانه در گستره بیلیون دلار داشته است.
دلایل این رشد انفجارآمیز عبارتند از حساسیت روش، سازگاری سریع آن برای انجام اندازه گیری های کمی دقیق، قابلیت آن برای جداسازی مواد و گونه های غیرفرار یا ناپایدار در مقابل گرما و مهم تر از همه، کاربرد گسترده آن برای موادی است که در صنعت، زمینه های مختلفی علوم و جامعه اهمیت بالایی دارند.
انجام تمامی آزمایش های تخصصی در آزمایشگاه مجهز دقیق شیمی. برای کسب اطلاعات بیشتر با شماره 09129483137 تماس حاصل کنید.
بیشتر بخوانید: آنالیز XRF چیست؟
بخش های مختلف دستگاه HPLC
دستگاه و تجهیزات HPLC شامل قسمت های مختلفی است که در ادامه به آن ها اشاره می شود:
1- مخازن حلا(Solvent Reservoir): که در آن ها فاز متحرک و یا حلال های شستشو دهنده ستون ریخته شده است.
2- موتور یا پمپ(Pump): به منظور انتقال حلال و همچنین نمونه در فضای نسبتا طویل ستون، نیاز به ایجاد فشاری در سیستم است که برای ایجاد آن حداقل از یک پمپ یا موتور استفاده می‌شود. حلال (فاز متحرک) توسط پمپ با سرعت و جریان ثابتی بر روی فاز ساکن حرکت داده می شود. فشار سیستم به اندازه (سایز) ذرات موجود در ستون، گرانروی (Viscosity) و سرعت جریان فاز متحرک بستگی دارد. بسته به نوع جداسازی، میزان سرعت جریان فاز متحرک تعیین می گردد.
در مواردی که با تعددی از آنالیت ها مواجه هستیم، هر گونه جدا شونده، خود را به صورت یک پیک در کروماتوگرام نهایی نشان می دهد. در سرعت جریان کمتر فاز متحرک، فاصله بین پیک ها افزایش یافته و جداسازی بهتری خواهیم داشت. معمولا گفته می شود که در ستون هایی با قطر مرسوم (کمتر از µm 5 (، سرعت جریان نباید بالاتر از ml/min5/2 باشد چرا که باعث صدمه زدن به ستون و کاهش عمر مفید آن می شود.
به عنوان فاز متحرک، مخلوطی از حلال ها در ازای یک حلال خالص می تواند به کار گرفته شود. نسبت اجزاء فاز متحرک در طی یک تزریق ممکن است ثابت باشد که در این صورت به آن روش ایزوکراتیک (Isocratic) گفته می شود. در حالتی دیگر که به آن روش گرادیانت (Gradient) گفته می شود، طی یک تزریق و با پیشرفت زمان، طبق برنامه ای که از قبل برای سیستم تعریف شده است، درصد متفاوتی از دو یا چند حلال مخلوط شده و در سیستم توسط پمپ جریان می یابد.
3- تزریق‌کننده (Injector): تزریق نمونه، بسته به نوع دستگاه، به دو شکل دستی و یا خودکار انجام می گیرد. در روش خودکار، نمونه در ظروف مخصوصی ریخته شده و در محل تعبیه شده در دستگاه قرار می گیرد. پس از اینکه اپراتور دستور تزریق را (از طریق نرم‌افزار) می دهد، نمونه توسط یک سرنگ به سیستم منتقل می شود. در روش دستی، از سرنگ هایی با ظرفیت های مختلف برای تزریق نمونه استفاده می شود. حجم نمونه تزریق شده (در هر دو روش)، به حجم حلقه نمونه بردار (Loop) بستگی دارد و مقدار آن معمولاً در حد 5 تا 500 میکرولیتر است. نمونه ابتدا وارد این حلقه شده و بعد از آماده شدن سیستم به همراه فاز متحرک وارد ستون می شود.
4- ستون: پس از تزریق، نمونه ابتدا وارد قسمتی به نام پیش ستون (Pre-column) یا محافظ ستون (Guard column) می شود. نقش این ستون، محافظت از ستون اصلی است. طول این ستون معمولا در حد سانتی متر است و جنس آن از فولاد ضد زنگ است. ماده پرکننده (Packing) ستون محافظ از جنسی مشابه ماده پرکننده ستون اصلی است.
هم جنس بودن نوع پرکننده این مزیت را دارد که اگر ماده ای که با ذرات ستون وارد واکنش شود در نمونه موجود باشد، در ابتدا در ستون محافظ به دام افتاده و به ستون اصلی آسیب نمی زند. طول ستون های اصلی دستگاه معمولا حدود 30-10 سانتی متر می باشد و درون ستون را با موادی که به یکی از دو فرم پوسته دار و یا متخلخل است، پر کرده اند.
سایز این مواد پرکننده که بر کیفیت جداسازی تاثیر فراوانی دارد، متفاوت بوده و معمولا در حد 3 تا 5 میکرومتر است. در سیستم های UHPLC اندازه این ذرات حدود µm 2 می باشد.
ستون می‌تواند قطبی و یا غیرقطبی باشد. از متداول ترین ستون های غیرقطبی می توان به C18، اکتادسیل سیلان (ODS) اشاره کرد. جنس ستون ها از فولاد ضدزنگ (Stainless Steel) است. پس از ورود نمونه به ستون، براساس تفاوت قطبیت، اجزاء مختلف نمونه در زمان های متفاوتی با نام زمان بازداری (Retention Time) از یکدیگر جدا شده و برای تشخیص نوع ماده به سمت آشکارساز(Detector) هدایت می شوند.
در نهایت پس از اتمام کار باید ستون را شستشو دهیم. برای شستشو، بسته به نوع ستون، حلال متفاوتی را با ترتیب خاص انتخاب می کنیم. برای مثال در ستون های غیرقطبی پس از اتمام کار، ابتدا ستون را با یک حلال قطبی (معمولا آب) و سپس با یک حلال غیرقطبی (معمولا متانول) شستشو می دهند.
بیشتر بخوانید: آزمایشگاه مینرالوگرافی
5- آشکارساز (Detector): آشکارساز بر اساس نوع آنالیت انتخاب می شود. به طور کل یک آشکار ساز خوب باید دارای ویژگی های زیر باشد:
• حساسیت بالا
• قادر به اندازه گیری مقادیر ناچیز نیز باشد.
• باید سریعا به پیک های باریک که از درون سلول به سرعت عبور می کنند به طور صحیح واکنش نشان دهد.
• باید محکم، ارزان قیمت و تنظیمات آن ساده باشد.
آشنایی با آشکارسازهای مرسوم
الف- از پرکاربردترین انواع آشکارساز: طیف سنج UV-Vis است که برای اجسامی که در این ناحیه جذب داشته باشند مورد استفاده قرار می گیرد. در این آشکارساز با استفاده از تفاوت میزان جذب نمونه با منبع نوری اولیه و در نهایت با استفاده از قانون بیر لامبرت، غلظت نمونه اندازه‌‌گیری می شود. در مواردی که از این آشکارساز استفاده می شود انتخاب طول موج مناسب یکی از مواردی است که می بایست مد نظر قرار بگیرد. در طول موج انتخابی، نباید مزاحم های موجود در نمونه و همچنین حلال جذب داشته باشند.
ب- آشکارساز فلورسانس: حساس تر از آشکارساز UV/Vis است ولی ترکیبات کمی موجودند که خاصیت فلورسانس داشته باشند؛ در نتیجه کاربرد این آشکارساز نیز محدود است.
بیشتر بخوانید: سنجش و اندازه گیری غبار محیطی
ج -دتکتور PDAT: دتکتور PDA دستگاه HPLC امکان تشخیص در کل طیف را به صورت همزمان فراهم می آورد. عبارت دتکتور PDA مخفف Photodiode Array Detector می باشد. آشکار ساز های UV و Vis دستگاه HPLC نتایج را بر اساس دو بعد زمان و شدت نور تعیین می کنند، در حالی که دتکتور PDA بعد سوم طول موج را نیز اضافه می کند. استفاده از دتکتور PDA در کروماتوگرافی مایع، امکان تعیین مناسب ترین طول موج، بدون تکرار آنالیز را به راحتی فراهم می آورد.
د- آشکارساز ضریب شکست: اساس کار این آشکارساز بر مبنای تغییراتی است که در ضریب شکست سیستم حلال به تنهایی و سیستم حلال همراه با نمونه، ایجاد می شود. پاسخ این آشکارساز به حرارت وابسته بوده و به همین دلیل معمولا به ندرت از آن استفاده می شود. این آشکار ساز عمومی بوده و برای ترکیباتی که در UV-Vis و فلورسانس جذب ندارند، مثل قندها به کار می رود.
ه- آشکارسازهای پراکندگی نور(ELSD)( Evaporative Light Scattering Detector): دتکتور پراکندگی نور تبخیری حساسیت خوبی برای ترکیبات غیر فرار در سطح نانوگرم فراهم می آورد. هنگام استفاده از دتکتور ELSD، خروجی ستون HPLC اسپری شده و پس از آن تبخیر می گردد تا ذرات ریزی را ایجاد کند، سپس نور لیزر به آنالیت تابیده می شود و بازتابش پراکنده شده آن توسط دتکتور تشخیص داده می شود. نمونه های آنالیز توسط دتکتور ELSD معمولا حاوی چربی، شکر و مواد با وزن ملکولی بالا می باشند. عملکرد دتکتور ELSD تقریبا مشابه دتکتور RI می باشد اما حساسیت تشخیصی بالاتر و پایداری مناسب تری را نسبت به آن فراهم می کند. از دیگر مزایای شناساگر ELSD نسبت به دتکتور RI کاربرد آن در متد گرادیان در آزمایشگاه می باشد.
و- آشکارساز الکتروشیمیایی: که عملکرد آن برپایه واکنش های اکسید و احیا می باشد و شامل روش های آمپرومتری(Amperometry) پلاروگرافی (Polarography)، کلون‌سنجی (Coulometry) و هدایت سنجی (Conductometry) است.
ی- آشکارساز طیف‌سنج جرمی (MS): این مورد امروزه به دلیل مزایای زیادی که دارد به طور وسیعی مورد استفاده قرار می گیرد. از این جمله می توان به حد تشخیص (LOD) بسیار پایین، حساسیت و انتخابگری (Selectivity) بالا، و امکان بررسی نمونه در حضور مزاحم های شیمیایی اشاره کرد.
در صورتی که از هیچ کدام از این موارد نتوان استفاده کرد، از مشتق سازی (ایجاد تغییرات شیمیایی روی نمونه) جهت ایجاد نمونه فعال در هر یک از این آشکارسازهای ذکر شده استفاده می شود. شکل زیر نمایی از یک دستگاه HPLC را به همراه اجزاء مختلف آن به تصویر کشیده است.